O propósito de garantir à Coroa Portuguesa o acesso à região sulina e dar continuidade ao reconhecimento da terra tendo como principal foco o interesse pela descoberta de riqueza mineral resultou no avanço para o interior do país.
Para atingir este objetivo Martim Afonso organizou uma expedição para subir a serra do Mar, seguindo as trilhas abertas pelos seus habitantes, vencer os seus contrafortes, seguir pela retaguarda da Serra de Paranapiacaba e assim atingir o planalto. Desta forma buscava uma alternativa, por via terrestre, para penetrar o interior do continente em direção às riquezas desejadas. O objetivo era estabelecer um posto avançado para se chegar ao Paraguai e ao sul do continente. Quer via rio Tietê, pela bacia do Prata, ou ainda pelos caminhos abertos pelos indígenas, o famoso Peabiru, ligando os campos de Piratininga até os confins do Paraguai.
O irmão, Pero Lopes, no seu diário de viagem, afirma que ele fundou uma vila, serra acima, a nove léguas pelo sertão, situada à margem do rio chamado Piratininga e nelas colocou gente e ordem de justiça. No entanto, quando muito teria Martim Afonso iniciado uma povoação que “para alguns dos autores que admitem sua existência, ficaria exatamente no mesmo sítio onde, sobre uma elevação, na confluência dos rios Tamanduateí e Anhangabaú seria depois plantada São Paulo. Não seria despropósito concluir, portanto, que Martim Afonso seria o fundador de São Paulo. Ou pelo menos, de uma proto São Paulo, uma povoação que duas décadas antes da data que se habituou a considerar como a da fundação da cidade, floresceu no mesmo lugar.” ( Toledo, 2012, 64)
Assim como Martim Afonso cumpriu a missão de articular a integração do litoral com o interior, o conhecimento e articulação das gentes foi realizada por João Ramalho. A ele coube a tarefa de aproximar os europeus recém chegados no litoral vicentino com os primitivos moradores do planalto de Piratininga. Os europeus, em sua grande maioria, eram constituídos por portugueses. Pero Lopes de Souza deixou registrado em seu diário que havia também espanhóis, italianos, franceses e alemães, dos quais muitos eram cristãos novos.
Serra acima moravam os guaianazes e os demais grupos indígenas que habitavam o planalto.
Contando com ajuda de João Ramalho expedição portuguesa de 1530 foi de São Vicente para o planalto e deu início à integração do litoral com o interior. Restou uma frustração: não conseguiram atingir as riquezas do interior do continente, nem pela serra acima, nem navegando pelo rio da Prata.
Martim Afonso de Souza regressou a Portugal em meados de 1553 não mais retornando a São Vicente, mesmo tendo recebido a capitania em 1535. Em uma das viagens que realizou à Índia chegou a parar em Porto Seguro para abastecer os seus navios e descansar, sem chegar a São Vicente.